野菊花和山楂核提取液对宫颈常见病原体抑菌效果的比较

   宫颈癌的发生是多种因素的结果，生殖道感染 的微生物种类增多，宫颈癌的风险增加。国内外学者认为，随着微生物菌种接触的增多，宫颈癌发生的危险将会增加。各种细菌性、病毒性、滴虫性、霉菌性感染等是否是直接导致宫颈癌的因素仍不能 明确，但当感染病原体的种类增加时，发生宫颈癌 的危险性也随着增高。针对感染性疾病，抗生素的滥用会导致药物的耐药性增加，甚至有超级细菌 出现，这已成为了严重危害人类公共健康的问题。 细菌在不同标本、不同病区的分离率和耐药性有较 大差异，宫颈感染的有效治疗依赖于鉴定患者样本，确定感染的病原体抗菌谱的能力。我国的中草 药资源丰富，中医学是我国的传统医学，随着中医药学的发展，中医的抗肿瘤、抗微生物作用越来越 受到学者们的重视，已经通过实验证明部分中药在 抗菌作用方面效果显著。山楂为蔷薇科植物山里红，落叶乔木，属于传统中药材，其果肉、叶和核均可以入药。野菊花在植物分类学中是菊科、菊属的多年生宿根草本植物性味甘、苦、凉，是一种重要的药食两用植物，用途广泛，野菊花及其有效成分具有抗肿瘤、调血脂、抑菌、镇痛、免疫调节、抗疲劳等多种药理作用。 

     １　材料与方法 

     １．１　仪器　立式电热压力蒸汽灭菌器 ；电子分析天平；旋转蒸发器；恒温水浴锅；数显 电热培养箱；微量多头接种仪。 

     １．２　试剂　山楂核提取液；中药野菊花；营养肉汤培养基；Ｍ－Ｈ 培养基；ＭｃＦａｒ－ ｌａｎｄ　０．５～５．０麦氏比浊管 ； 实验用水为二次蒸馏水。 

     １．３　菌种　标本来自齐齐哈尔医学院附属三院妇产 二科，一共搜集２３４例就诊患者的标本，所有菌株 均在微生物检验科采用ＢＤ公司全自动细菌鉴定／药 敏检测系统鉴定，鉴定出大肠埃希菌 ６８ 株，占 ２９．０５９８％，金黄色葡萄球菌５０株，占２１．３６７５％， 白色念珠菌４０株，占１７．０９４０％。将菌株置于冷冻 菌株管中保存。质控菌株为大肠埃希菌 ＡＴＣＣ ２５９２２、金黄色葡萄球菌 ＡＴＣＣ　２５９２３、粪肠球菌 ＡＴＣＣ　２９２１２和白色念珠菌 ＡＴＣＣ　１０２３１，由齐齐哈尔医学院检验实验中心提供。 

    １．４　制备 

    １．４．１　菌悬液的制备　取大肠埃希菌、金黄色葡萄 球菌、白色念珠菌冷冻菌株管，室温使其融化分散。 分别划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基进行菌种斜面 活化，于３７℃培养２４ｈ后，用０．９％ ＮａＣｌ溶液进 行洗脱，恒温震荡２ｈ，即制得菌悬液。取含１０ｍＬ 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置３７℃ 培养２４ｈ，此为第１代菌培养物。用接种环取１代 菌悬液划线接种于营养琼脂培养基平板上，于３７℃ 培养２４ｈ，此为第２代菌培养物。挑取第２代培养 物中的典型菌落，接种于营养琼脂培养基平板上， 于３７℃ 培养 ２４ｈ，即为第 ３ 代菌培养物。使用 ０．９％ ＮａＣｌ溶液将第３代菌培养物进行洗脱，制备 成菌悬液。根据麦氏比浊管浓度标准，使用 ０．９％ ＮａＣｌ溶液将菌悬液系列稀释，制成含菌量为１×１０ ５～１×１０ ８　ＣＦＵ／ｍＬ的实验菌悬液。 

    １．４．２　野菊花乙醇提取物的制备　本实验将采 购的野菊花用蒸馏水冲洗干净，然后放到干燥箱中烘 干、粉碎。取野菊花１０ｇ，精密称定，加１６倍量水 煎煮２ｈ，加１２倍量的水煎煮１ｈ，滤过，合并滤液， 用旋转蒸发器减压浓缩至生药含量为５ｇ生药／ｍＬ， 加乙醇至含醇量为７０％，醇沉２４ｈ，滤液减压回收 至无醇味，加蒸馏水调至生药含量为２０００ｍｇ／ｍＬ， 作为供试品溶液。 

    １．４．３　药物浓度梯度的制备 

    １．４．３．１　野菊花乙醇提取物浓度梯度的制备   准备 ４个空白试管，使用微量移液器在每个试管中加入 无菌生理盐水１ｍＬ，吸取１ｍＬ原液，加入第一个 试管中，混匀，用微量移液器从第一个试管中吸取 １ｍＬ液体加入第二个盛有１ｍＬ的无菌生理盐水的 试管中，依次做倍比稀释，制成四种稀释度的稀释 液，即１００％、５０％、２５％和１２．５％，每个试管中 药物容量为１ｍＬ。 

    １．４．３．２　山楂核提取液浓度梯度的制备　制备方法 同１．４．３．１ 

    １．５　药敏试验　将不同浓度的野菊花、山楂核提取 液分别混匀于 Ｍ－Ｈ 琼脂 培 养 基 中，配 制 出 含 １００％、５０％、２５％和１２．５％浓度药物的平板。使 用微量多头接种仪将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌分别接种在各浓度平板上，每个药物重 复测定３次，３７℃孵育２４ｈ后观察细菌在含不同浓 度药物的平板上的生长情况，以抑制细菌生长的平 板所含的药物浓度测得最低抑菌浓度 ＭＩＣ。每个药 物重复测定３次，并设不含药物的Ｍ－Ｈ 培养基作为阴性对照。 

   １．６　统计学分析　应用ＳＰＳＳ　１７．０统计软件，计数 资料采用 χ ２ 检验， Ｐ ＜０．０５为差异有统计学意义。 

   ２　结　果 

    从表１可以看出，野菊花、山楂核提取液对大 肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有不同程 度的抑菌效果，三种菌的总抑菌效果差异有统计学 意义 （ χ ２＝２１．７８１， Ｐ ＝０．００００＜０．０５），四种浓度药物的实验，两两比较后得出山楂核的抑菌效果更 好，抑菌率明显高于野菊花组，差异有统计学意义 （ χ ２＝８．６６６０， Ｐ ＝０．００３０＜０．０５）。山楂核对大肠 埃希菌、金黄色葡萄球菌的 ＭＩＣ９０为中药稀释度 ５０％，中药稀释度为５０％时，两种中药差异有统计 学意义 （ χ ２＝１３．８５２， Ｐ ＝０．００１０＜０．０５），当两种 中药药物浓度达到１００％时，两种药物平板中均无 菌落生长，抑菌率相同，均为１００％，差异无统计 学意义。

    ３　讨　论

    ３．１　宫颈感染标本中三种常见病原体的分布　生殖道感染病原体中以细菌感染最为常见，本研究中收集的标本大肠埃希菌分布率为２９．０５９８％，占比例最高，这与刘朝晖等报道的一致。 

    ３．２　两种中药对三种宫颈感染标本中常见病原体的耐药分析　野菊花对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌作用，这与曾帅等进行的野菊花水煎液体外抗菌实验结果一致。野菊花对白色念珠 菌的抑制与汪长中等报道的最低抑菌抑菌范围有偏差，这可能与野菊花的提取方式不同有关，也可 能与野菊花的采集季节不同有关。 

    ３．３　本研究的意义及创新性　山楂核提取液为棕褐色粘稠液，含有有机酸、酚类等成分，在治疗生殖道感染疾病时，具有良好的杀菌作用，但根据临床观察，在治疗宫颈感染疾病中，很多患者主述使用红核洗液清洗有阴道刺激、灼烧感，并伴有反复感染的情况。菊花始载于唐 《本草拾遗》，其根、茎、叶、花均可药用，具有调中止泻、破血，治痈 肿、疗毒、瘪疡、眼痣的功效。根据文献报道以及本实验研究，野菊花具有良好的抗菌活性，而且资源丰富，安全性高，具有良好的临床应用前景。将野菊花应用于宫颈感染性疾病的治疗还很少 见，本实验通过选取三种宫颈常见的病原体，提取野菊花有效成分进行体外抑菌试验，发现野菊花对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌确实有良好的抑菌作用，其结果差异有统计学意义，这为临床治疗宫颈感染性疾病提供了实验室依据和研究方法。